Сохранилась доныне и находится над северными проездными воротами кремля. Первое упоминание об этом храме относит нас во времена глубокой древности, когда Астрахань, будучи одним из татарских улусов, была покорена державой московских царей. Тогда, в 1556 году, царь Иоанн Грозный, посылая русскую рать для усмирения астраханского хана-изменника Дервиш-Али, вручил воеводе Ивану Черемисинову образ Святителя Николая Чудотворца, именуемый Можайским. Эта икона стала походной у русских воинов и сопутствовала им, находясь в походной церкви, со специально приставленным священником. После устройства Черемисиновым в 1558 году новой Астрахани на левом берегу Волги икона с походной церковью была перенесена сюда и поставлена посредине воздвигнутого острога. В скором времени была построена и постоянная деревянная церковь в честь Святителя Николая. Находилась она тогда примерно в центре кремля, ближе к современным Никольским воротам и Троицкому собору. Достоверно подтверждается источниками, что в 1568 году эта церковь уже была. В этом году в Астрахань прибыл игумен Кирилл с повелением от царя Иоанна Грозного: «В городе у Николы Чудотворца устроить монастырь общий».
В 1589 году началось строительство каменного астраханского кремля. В процессе этого строительства Никольская церковь была перенесена на северные проездные ворота, которые также стали называться Никольскими. Чтимая икона Николая Чудотворца была вынесена из храма и поставлена в особой часовне за кремлёвской стеной. С самого времени своего основания Никольский храм был бесприходским и считался ружным. В 1698 году по соизволению митрополита Сампсона этот храм поступил в ведение собора и он стал приписным. Соборные священнослужители совершали здесь богослужения и пользовались от дохода храма. 10 февраля 1701 года по указу императора Петра Первого, в связи со значительными расходами на военные нужды, было сокращено выдаваемое ружным церквам государственное жалование. Так, согласно этому указу, в церковь Николая Чудотворца, что на воротах, выдавалось 1/2 пуда воску, 1 фунт ладану и 1/2 ведра вина в год, а также той же церкви попу 8 руб., дьякону 2 руб. и двум сторожам по 2 руб. Видимо, оклад этот был самым ничтожным и мало привлекал соборное духовенство. Служба здесь стала совершаться всё реже. К тому же построенный более века назад храм сильно обветшал и требовал капитального ремонта. Средств на это также не находилось. В 1728 году по распоряжению астраханского губернатора фон Менгдена Никольская церковь за ветхостью была сломана, а иконостас с утварью были перенесены в Успенский собор.
Новый, настоящий храм был построен по инициативе астраханского купечества. 15 апреля 1729 года их представитель купец Афанасий Крашенинников обратился к Астраханскому епископу Илариону с просьбою выдать ему храмоздательную грамоту для закладки церкви. К 1739 году строительные работы были закончены, и в этом же году новосооружённый храм был освящён епископом Иларионом.
В скором времени Никольская надвратная церковь была передана в военное ведомство и приписана к военному госпиталю, а позже к Кавказскому линейному батальону. В 1843 году, после перевода линейного батальона на Кавказ, храм был снова передан в епархиальное ведомство. Но в 1844 году, вследствие ходатайства 2-го батальонного командира (астраханского гарнизона) майора Роде, он был передан ему во временное заведывание. Позже Никольская церковь была причислена к выстроенному рядом с нею гарнизонному лазарету.
В 1890 году, по благословению Астраханского епископа Павла (Вильчинского), Никольский надвратный храм был передан во временное пользование единоверческой общине. В её ведомстве он находился до 1895 года, когда единоверцами был построен собственный храм на Кремлёвском съезде в районе Косы. После этого Никольская церковь снова перешла в полное распоряжение астраханского гарнизонного госпиталя, в ведении которого она находилась вплоть до 1917 года.
Внешний и внутренний вид храма
Храм был построен в древнерусском стиле, без лишних деталей декора, со скатною, покрытою черепицей крышей, имеющей первоначально одну небольшую главку с узорчатым прорезным крестом. Алтарь храма был устроен вровень со стенами, только крыша его была немного ниже церковной. Храм первоначально не имел притвора, роль которого выполняла пристроенная с западной стороны галерея, закрытая с трёх сторон тесницами с семью рамами. Эта галерея была связана с открытою каменною галереей, охватывающей северную и восточную стороны храма. По этой галерее совершались крестные ходы с обхождением вокруг храма в Страстную пятницу с плащаницей и на Пасху. В начале XX века крытая западная галерея была переделана в каменный притвор, сам храм получает некоторое украшение в виде малых боковых главок и кокошников с западной стороны. В это же время с южной стороны притвора пристраивается ажурная колокольня, через которую был устроен вход в церковь. С юго-западной стороны к храму примыкал одним углом военный госпиталь, из которого был сделан ход на площадку парадной лестницы, чтобы больные могли свободно проходить в храм и присутствовать на богослужениях. Чтимый астраханцами образ Святителя Николая, именуемый Можайским, после постройки нового храма был перенесён в часовню, устроенную в Никольских вратах, прямо под алтарём храма. К этой иконе во множестве приходили люди, обращаясь к великому угоднику Божию в своих нуждах и несчастьях, в надежде на его быструю помощь. В часовне находилась также икона Божией Матери «Всех Скорбящих Радосте», написанная на средства солдат астраханского батальона.
В феврале 1918 года храм был закрыт советскими властями и использовался ими для нужд военного ведомства – долгое время здесь размещались гужмастерские. Иконостас и роспись Никольского храма, кроме росписи на потолке, были уничтожены. Заложены были боковые входы в алтарь, разрушены солея и амвон. Чтимая икона Святителя Николая вместе с другими храмовыми образами пропала неизвестно куда. В 30-х годах XX века была разобрана колокольня храма вместе с каменной лестницей, ведущей наверх, сняты кресты и уничтожены боковые главки. В 1958 году, в связи с 400-летием со дня основания города Астрахани, здание Никольской надвратной церкви было передано из военного ведомства Управлению культуры облисполкома. 14 ноября 1974 года на основании приказа Астраханского облисполкома «комплекс историко-архитектурных памятников Астраханского кремля», в том числе и Никольская церковь, был передан Астраханскому краеведческому музею. Реставрация же храма, запроектированная ещё в 60-х годах, началась только в начале 80-х. В результате этих реставрационных работ была восстановлена галерея с южной стороны храма, здание военного госпиталя было разобрано, а лестница в храм сооружена с запада с выходом на стену. Позже была реставрирована подкупольная роспись в храме и на главках водружены кресты.
После окончания реставрационных работ в конце 80-х годов в Никольской церкви была организована выставка старопечатных книг, которую вскоре пришлось свернуть из-за высокой влажности в помещёнии храма. Новая выставка по истории Астраханской епархии была открыта в 1995 году. Всё это время, начиная с начала 90-х годов, между департаментом культуры и Астраханской епархией шли переговоры о возвращении Никольской церкви в епархиальное ведомство. В 2001 году договорённость о передаче храма была достигнута, выставку из его помещёния убрали, но, к сожалению, он до сих пор стоит закрытый. Об этом с горечью 22 мая 2002 года, стоя перед зданием Никольской церкви, говорил настоятель Успенского собора иеромонах Дмитрий (Приз). В этот день – день памяти перенесения мощей святителя Николая из Мир Ликийских в г. Бар – из собора к Никольской церкви состоялся крестный ход. Участники его молились, чтобы благое пожелание о возвращении храма епархии не осталось втуне и своды Никольского храма – начатка астраханского храмостроительства – снова бы огласились радостными звуками церковных песнопений.