До 1735 года в станице была деревянная церковь во имя Димитрия Солунского.

В 1769 году обветшалая церковь была перестроена, возведена колокольня. В архивных документах «Ведомость о церкви за 1829 год» написано, что Димитриевская церковь имеет ветхую кровлю.

Каменная церковь Успения Пресвятой Богородицы строилась с 1820 года на средства прихожан. Фундамент заложили из прочного калитвенского камня, который возили из Савочкиной балки, а местные камнетесы его обрабатывали. Наземная часть здания возводилась из керамического кирпича. Для кладки применялся традиционный известково-песчаный раствор с добавкой яичного белка, обеспечивающий высокую прочность несущих кирпичных конструкций. Особое участие в строительстве принимал войсковой старшина Андрей Евстафьевич Хорошилов, по тем временам, очень богатый казак. Храм, по оценке современников, вышел один из лучших в Епархии и освящен в 1833 году. Архитектор И. Е. Старова. Главный придел храма в честь Успения Пресвятой Богородицы, северный придел храма — в честь Димитрия Солунского, южный придел храма — в честь Иоанна Предтечи. В 1872 году вокруг храма была установлена ограда.

В годы Великой Отечественной войны храм подвергался обстрелам, был повреждён. Точных сведений о времени закрытия церкви нет. По некоторым данным церковь закрыли во время войны. Сохранился договор о передаче православной общине с описанием состояния церкви на 1944 год: церковь – каменное здание, крытая железом, требует ремонта, окна без стекол, иконостас – первый ярус без икон... С 1944 года храм потихоньку восстанавливается.

В феврале 1960 года было принято решение Ростовским областным Советом депутатов трудящихся об изъятии здания Успенской церкви и переоборудование ее под учебно-производственные мастерские и спортзал. Но пройдет еще более года и церковь будет окончательно закрыта. Это случится 28 марта 1961 года. В этот день были вывезены культовое имущество, иконы, кресты. Все было передано в Астаховскую церковь. В сумерках были срезаны кресты с маковок колокольни и центрального купола.

В 1988 году в Успенской церкви станицы Калитвенской зарегистрирована религиозная община. Новые купола, изготовленные на Воронежском заводе, установлены 29 сентября 2005 года.