Знаменская церковь располагается северо-западнее Преображенского собора. Здесь находится родовая икона бояр Романовых — икона Божией Матери «Знамение». Храм возвел царь Михаил Федорович над местом погребения представителей семейства Романовых.

К концу XVIII века храм настолько обветшал, что его были вынуждены разобрать. В 1791 году близ этого места появилась новая Знаменская церковь. Ее проект составил баженовский ученик архитектор Е. С. Назаров. 15 января 1795 года епископ Воронежский Мефодий, бывший наместник Новоспасского монастыря, освятил храм.

Наполеоновские солдаты устроили в церкви конюшню. Церковь была вновь освящена в 1813 году.

Знаменский храм представляет собой двухэтажное сооружение. В верхнем этаже располагаются хоры, в нижнем — усыпальница. Здесь погребены князья Лобановы-Ростовские, Черкасские, Сицкие и Урусовы. Под алтарем храма — фамильная усыпальница графов Шереметевых.

Когда большевики устроили в обители женскую тюрьму, в Знаменском храме находились жилые помещения для заключенных. Позже, в 1930-е годы, здесь приводили в исполнение приговоры «троек». Людей привозили в церковь якобы для санобработки и, заводя внутрь, расстреливали. После войны в храме обосновался вытрезвитель, освободивший «помещение» лишь в 1967 году.