Митрополит Филарет добился, чтобы в 1854—1857 гг. три храма на Преображенском кладбище и один на Никольском стали единоверческими. Важной мерой для укрепления единоверия Филарет считал создание единоверческого монастыря, который должен был подготовить собственное духовенство. Филарет полагал, что такое духовенство будет пользоваться большим доверием и авторитетом.

В 1866 году по настоянию митрополита Московского Филарета на месте федосеевской мужской обители был открыт Никольский единоверческий мужской монастырь. Жившие там старообрядцы были выселены.

В 1887 и 1897 годах в Никольском единоверческом монастыре проходили съезды противораскольничьих миссионеров. А в 1907 году там находились игумен, 22 монаха и 41 послушник.

Никольский монастырь благодаря деятельности его настоятеля архимандрита Павла стал центром миссии среди поповцев и полемики с расколом. Павел Прусский (1821—1895), в миру Петр Лебедев, был в юности фанатичным приверженцем беспоповцев-федосеевцев. Сначала он был монахом в Стародубе, затем в 1847 г. уехал в Пруссию, чтобы основать там монастырь этой общины. Близ Иоганнисбурга он открыл типографию и ревностно занялся апологией раскола, результатом этих занятий был совершенно неожиданный переход в православную Церковь, совершенный вместе с пятнадцатью монахами своего монастыря. Павел сумел завоевать доверие митрополита Филарета, оценившего его познания в области учения старообрядцев, их методов апологетики и тонкостей их казуистики и увидевшего в Павле талантливого миссионера. Так Павел стал настоятелем Никольского монастыря и самым ревностным деятелем единоверия во 2-й половине XIX в.

О жизни монастыря в последний период его дореволюционного существования рассказывает письмо очевидца, приведенное в сборнике «Сорок сороков»:

«Монастырь этот имеет очень уединенный вид — настоящее убежище для любителей созерцательной жизни. Красивый, как будто готической архитектуры храм темно-красного цвета с желтыми украшениями, довольно стройная кирпичная колокольня, вдали кельи, тоже в готическом стиле, одноэтажный белый домик настоятеля, пятиглавая зимняя церковь над святыми воротами с знаменитой Хлудовской библиотекой при нем... Всюду трава, по местам деревца, яблочный сад, маленькое братское кладбище — и тишина, тишина!.. Видел я и молодого их архимандрита о. Никанора: о нем я слыхал от его товарища по семинарии, еще и сейчас учащегося у нас на философском отделении. По отзыву другого студента — старообрядца, о. Никанор — человек очень строгий, но строгий по любви к аскетизму. Как любезно нас они приняли там! Иеромонах, по-видимому научно знакомый с древним искусством, показал нам подробно всю старину летнего храма... Особенно восхитил... образ Богоматери в главном алтаре; изображение это там называют «Голубицей»: на руках Богоматери младенец Христос в белой одежде держит на руках белого голубка. Старинная и прекрасная икона!..

Вообще все иконы в монастыре — XIV, XV, XVI, XVII веков. Даже вверху стены украшены не живописью, а вставленными в скульптурные рамы иконами».

Кроме икон главной ценностью монастыря была его библиотека — ценное собрание древних рукописей и старопечатных книг, пожертвованных Алексеем Ивановичем Хлудовым. Во втором номере «Московских церковных ведомостей» за 1902 год говорится о том, что «первое начало библиотеки А. И. Хлудова было положено любителем книжной старины А. И. Озерским; по переходе к Хлудову собрание росло и умножалось, приобретались памятники полемики и истории раскола целыми библиотеками. Сюда вошло собрание рукописей А. Ф. Гильфердинга, А. И. Лобкова. К 361 рукописи Хлудовских монастырем приобретена еще 171 рукопись. Подобного собрания полемических сочинений о расколе, насчитывавшем более 200 рукописей, нет ни в одном из книгохранилищ. Имеются важные памятники для истории славяно-русской литературы. Среди них творения Иоанна Дамаскина в переводе кн. А. М. Курбского со собственноручными заметками».

В начале 20-х годов монастырь был закрыт, а Хлудовская библиотека передана большей частью в Российскую библиотеку им. В. И. Ленина (ныне Российская государственная библиотека), иконы — в Государственный Исторический музей. Сейчас несколько икон находятся в Третьяковской галерее. Это «Облачным чином» (середина XV века), «Феодор Сикеот и Георгий с житием Феодора Сикеота» (конец XVI — начало XVII века), «Рождество Николы, с житием» (1601 год), «Принесение убруса Нерукотворного образа» (первая четверть XVII века), «Богоматерь Владимирская» (конец XVI — начало XVII века).

В 1930-е годы стены и башни монастыря были разобраны, а юго-восточную часть его территории заняло расширившееся кладбище. Монастырские постройки оказались во владении различных учреждений. И только в 1977 — 1980 годах под руководством И. К. Русакомского были отреставрированы колокольня и сохранившаяся часть монастырских стен.