В 1684-1698 годах рядом с Малым собором по обету сестры Петра I царевны Екатерины Алексеевны был построен новый собор Донской иконы Божией Матери, гораздо больший по размерам и оттого прозванный Большим. Обет был дан, очевидно, в связи с подписанием Бахчисарайского мира России с Турцией и Крымским ханством. Строительство финансировалось «из царских сокровищ». Большой собор освятил 21 августа 1698 года митрополит Сарский и Подонский Преосвященный Тихон. Величественный храм был расписан в 1782-1785 годах; настенные росписи на библейские сюжеты выполнил художник Антонио Клаудо по эскизам В.И. Баженова. Стены алтаря на протяжении почти двух веков украшала роспись под мрамор. С возрождением монастырского служения в алтаре была выполнена роспись в традициях древнерусской живописи, сюжет ее традиционно связан с таинством евхаристии. До настоящего времени в Большом соборе сохранился семиярусный резной иконостас с иконами, выполненный в стиле «московского барокко» мастерами Посольского приказа и Оружейной палаты в Кремле К.Золотаревым, А.Андреевым, И.Федоровым. Несмотря на то, что иконостас неоднократно поновляли и реставрировали, он почти полностью сохранил свой первоначальный облик. Иконы иконостаса в большинстве своем конца XVII века. Многие из них были отреставрированы к юбилею монастыря в 1991 году. В местном ряду иконостаса установлена Донская икона Божией Матери, написанная в XVI веке. Ныне над ней сделана нарядная сень.