На этом месте в крепости стоял деревянный собор ещё во времена Серпуховского князя Владимира Андреевича (XIV век). В XVI веке построена каменный собор.

В 1696 году собор перестроен на средства архимандрита Московского Спасо-Андроникова монастыря Феодосия, в прошлом священника Троицкого собора. Частично включает кладки здания собора XVI века.

В 1514 году грамотой Василия III подтверждены старинные привилегии духовенства Троицкого собора. Его протопопу люди, приезжавшие торговать в Серпухов, должны были платить таможенную пошлину, треть средств шла на содержание построенного в крепости ещё князем Владимиром Андреевичем Храбрым храма Великомученика Димитрия Солунского. Протопопы собора собирали венечную пошлину со всего Серпуховского уезда. Кто венчался без уплаты её, подлежал штрафу в два рубля (очень большая для тех времён сумма). В XVII веке в соборе был придел святого мученика Димитрия Солунского, позже разобранный.

В 1837-1841 годах собор капитально перестроен. Восстановлен придел святого мученика Димитрия Солунского, пристроен придел святителя Николая Мирликийского (храм Святителя Николая издревле стоял в Серпуховском кремле южнее Троицкого собора), изменены завершение колокольни и восьмерик храма.

В советское время, в конце 1930-х годов, Троицкий собор закрыли. В настоящее время в нём размещён филиал Серпуховского историко-художественного музея.

21 сентября 2003 года собором духовенства Серпуховского благочиния отслужен первый со дня закрытия храма молебен с водоосвящением.

С 1795 по 1797 год настоятель Троицкого собора протоиерей Павел Яковлевич Озерецковский. В середине XIX века в соборе служил протоиерей А. И. Левитский. Митрополит Иоанн (Снычев) в книге "Жизнь и служение митрополита Мануила" пишет, что в иосифлянский раскол уклонился и остался непримиримым настоятель Троицкого собора, благочинный церквей Серпуховского округа, священник Александр Анатольевич Кремышенский (в 1931 году расстрелян). В 1937 году расстрелян настоятель Троицкого собора протоиерей Василий Студницын.