Первый в Рыбинске каменный храм во имя Преображения Господня был построен в 1654—1660 годах на месте двух деревянных церквей начала XVII века — Преображенской и Петропавловской. В 1779 году указом Ярославской духовной консистории этот храм получил статус городского собора. Колокольня построена в в 1797—1804 годах.

14 июня 1838 года в соборе была отслужена последняя литургия. 8 сентября 1838 года на месте уже разобранного храма был совершён чин закладки нового собора. 29 июня 1851 года торжественным архиерейским чином архиепископ Евгений (Казанцев) освятил только что устроенный храм построенный по проекту ректора Академии художеств А. И. Мельникова. Новый собор, вмещающий более 3000 молящихся.

«Я был в земном раю. Не знаю, сподобит ли меня Господь быть в раю небесном?.... Я был в Рыбинском соборе!» - так писал в прошлом веке архиепископ Ярославский и Ростовский Ионафан (Руднев) после посещения храма в 1881 году.

В 1929 году собор был закрыт. Большая часть колоколов его звонницы сброшена (один колокол конца XVIII века был оставлен для боя часов). Собор был лишён пятиглавия. В самом здании собора позже устроено общежитие.

В результате реставрационных работ с 1963 года было восстановлено пятиглавие, а затем и часовой механизм, и позолоченный шпиль колокольни. С 1982 по 1999 год в здании собора располагался Рыбинский филиал Государственного архива Ярославской области.

В 1991 году была зарегистрирована церковная община Рыбинского Спасо-Преображенского собора, но первые богослужения здесь были проведены лишь спустя пять лет, когда в 1996 году соборная колокольня и галерея-трапезная были переданы Русской православной церкви. Основное здание собора было передано в безвозмездное пользование Ярославской и Ростовской епархии 18 ноября 1999 года.