Монастырь основан в 1615 году.

В начале XVII века на месте монастыря по бывшей улице Пробойной, ныне Советской, стояли посадские деревянные храмы Воскресения, Кирилла и Афанасия. Предание связывает с ним избавление города от мора в 1612 году, когда здесь стояло ополчение Минина и Пожарского. Благодарные горожане за один день («обы ден») срубили между старыми храмами новый, в котором был поставлен образ Спаса. Храмы вскоре сгорели. Приходские Воскресенский и Спасский храмы возобновили, а на месте храма Кирилла и Афанасия был основан монастырь, первоначально деревянный.

Церковь Кирилла и Афанасия построена в 1664 году. Храм окружён с двух сторон галереями и приделами. В 1776 году построен северный придел с галереей. В 1830-1832 годах приделы надстроены, окна увеличены, шатровая колокольня заменена ярусной в классическом стиле (не сохранилась).

Церковь Спаса Неруковтоворного (Спасо-Пробоинская) построен в 1696-1705 годах. Храм двухэтажный с трапезной, с высокой папертью, с южной стороны кельи, две надвратные башни с четырехгранными куполами, построенные в конце XVIII века; первоначально одноглавая, с шатровой колокольней. В 1779 году построены 4 малые главы. В 1831 году колокольня перестроена (не сохранилась). В 1831-1833 годах трапезная превращена в теплую церковь. В начале 20 века с южной стороны храма пристроена двухэтажная паперть с крыльцом.

Территория монастыря была небольшой и обнесена невысокой каменной стеной только с восточной и северо-восточной стороны, с других сторон ограду монастыря заменяли «надворные строения обывательских домов и церковь Спасо-Пробоинская». По парадному восточному фасаду обители, выходившему на Пробойную улицу, еще в XVIII веке построили две небольшие каменные башни, одна из которых служила Святыми воротами, в другой была устроена часовня в память о важном событии - обретении чудотворной иконы Спаса Нерукотворного.

25 июня 1768 года в центральной части Ярославля случился пожар. От огня пострадали оба храма, игуменские и братские кельи, кухня, конюшня, каретник, баня, погреба, ограда. Во время восстановительных работ после пожара 1768 году была поновлена живопись церкви св. святителей Афанасия и Кирилла, ее первоначальный каменный иконостас заменен деревянным.

В 1820-1830-х годах в монастыре велись значительные работы по его благоустройству. 12 декабря 1857 года император Александр Николаевич утвердил определение Святейшего Синода о возведении Афанасиевского монастыря в степень третьеклассной обители, с этого времени ее настоятели имели сан архимандритов. С 1895 года Афанасиевский монастырь стал резиденцией викарного епископа Ярославской епархии.

Значительные работы по благоустройству обители велись в XIX веке, построены настоятельские покои, братские кельи, обновлены иконостас и росписи святительского храма. Благотворителем обители был Иван Александрович Вахромеев, на средства которого в обители неоднократно проводился капитальный ремонт. В 1897 году возведены каменные погреба, сарай, каретная, конюшня, баня. В 1903 и 1907 годах на средства Ф. Е. Вахромеева проводились ремонтные работы в соборной церкви. В 1912 году на пожертвования А. И. Вахромеева настенную живопись храма поновлял известный художник и реставратор М. И. Дикарев.

Во время событий 1918 года в обители пострадали две церкви, сгорел один жилой корпус. В послереволюционные годы при Афанасьевском монастыре зарегистрирована приходская община.

В феврале 1925 года монастырь закрыли, часть "ветхого культового имущества" передали в церковь Спаса на Городу и ряд других храмов. В 1930-х годах городские власти разобрали колокольню, в церкви Афанасия и Кирилла и части других строений монастыря разместились производственные мастерские и организации, в братском корпусе поселились люди.

В ноябре 2007 года храм и ограда с башнями Святых ворот были переданы Русской Православной Церкви. 31 января 2008 года в приделе Алексия, митрополита Московского, совершена была первая служба.

Русской церковью канонизированы священномученик Вениамин (Воскресенский) епископ Романовский, бывший настоятелем обители в 1921-1922 годах, скончавшийся в ссылке в 1932 году, преподобномученик иеромонах Алексий (Задворнов), бывший насельником монастыря с 1912 года до закрытия, расстрелянный в 1937 году, священномученик иерей Михаил Зеленцовский, служивший в монастыре псаломщиком, расстрелянный в 1937 году. Пока не прославлен во святых священномученик Кирилл (Соколов), епископ Любимский, бывший настоятелем в 1922 году, расстрелянный в 1937 году.