Новопостроенный храм был заложен в 2001 году на территории 5-го роддома г. Киева. Частичное финансирование храма проводилось силами городской администрации и главного врача роддома. На эти деньги удалось заложить фундамент и возвести кирпичные стены храма.
В связи с недостаточным финансированием строительные работы были прекращены, что привело замораживанию каких-либо работ до 2003 года.

В начале 2003 года настоятелем храма «Знамение» Божией Матери по благословению Блаженнейшего Владимира Митрополита Киевского и всея Украины был назначен иерей Георгий (Юрий) Стороженко.

В течении 2004 года стараниями и молитвой священника и прихожан (жертвователей) удалось провести внутренние работы в храме. Первое Богослужение в Церкви было совершено на Пасху 2003 года. С этого времени в Храме правиться служба Божия, служатся молебны, проходит таинство Венчания, дети - принимают таинство Крещения и Причастия.

В 2004 году на стены церкви была нанесена роспись в академическом стиле. А в 2005 году главврачом 5-го роддома Макаренко Михаилом Васильевичем был пожертвован резной иконостас, выполненный из дуба.