Есть в обители и храм, посвященный Преподобному Сергию. Он расположен с южной стороны Зачатьевского собора, на месте, где при основании обители был водружен Крест и воздвигнута первая деревянная церковь. Основанием его служит храм во имя небесного покровителя Серпухова — святителя Христова Николая, во втором этаже здания расположена соборная ризница, над ней — церковь во имя Преподобного Сергия. Внешняя реставрация здания произведена в 1991 году.

Сергиевская церковь существовала уже в конце XVI в. Во вкладной книге монастыря упоминается, что в 1618 году архимандрит Иосиф жертвовал деньги на ремонт Сергиевского храма, пострадавшего в разрушительное и бедственное время междуцарствия. Храм неоднократно перестраивался и ремонтировался. В нем сохранялся иконостас XVIII в. Царские врата являлись одним из лучших образцов русской резьбы по дереву XVII в. Мерзость запустения коснулась и этого храма. Из его внутреннего убранства ничего не сохранилось. Реконструкция интерьера Сергиевского храма была начата зимой 1996 года. Храм был вновь оштукатурен, заменены оконные рамы и двери, настелены дубовые паркетные полы. Изящная резьба трехъярусного иконостаса и настенных киотов выполнена выпускниками Абрамцевского художественного училища в стиле XVI века. Особенно великолепно тончайшее кружево Царских врат. Иконы иконостаса и чудная настенная живопись воспроизведены в древнерусском стиле художником-реставратором 1 категории В. В. Артемьевым. В куполе храма изображение Святой Троицы и трех евангельских событий — искушения Христа в пустыне, умовения ног и моления о чаше. Они напоминают о необходимости неустанной борьбы с искушениями, непрестанной молитвы, смирения и послушания. Ниже — жизнь Преподобного Сергия, образец монашеских трудов и подвигов. На горнем месте находится старинная чудотворная икона Божией Матери «Всех скорбящих Радосте». Она особенно чтилась в одном из ныне уничтоженных подмосковных храмов, по просьбам верующих ее носили с Крестными ходами по окрестным селениям. В храм Преподобного Сергия с галереи собора ведет узкая крутая лестница, он совсем маленький и необычайно радостный и теплый. Его освящение состоялось 6 сентября 1996 года, в день празднования явления Божией Матери Преподобному Сергию. Освящение совершалось ночью, в присутствии только братии, так как храм не мог вместить богомольцев. Необычность священнодействия, ночной Крестный ход со святым Антиминсом под звон колоколов «во вся», переживание духовной радости живо напомнили Пасху. В дни, связанные с памятью Преподобного Сергия (18 июля, 6 сентября, 8 и 20 октября) в этом храме совершается ранняя Литургия.